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POUR LA RECHERCHE
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POUR LA RECHERCHE
L’équipe de production de protéines de Genosphere Biotechnologies offre des services complets pour l’expression, la production et la purification des protéines.
Faites-nous savoir quelle protéine est intéressante pour votre recherche et nous la produirons pour vous selon vos spécifications.
Nos protéines recombinantes ont été utilisées avec succès dans une large gamme d’expériences, y compris le développement d’anticorps, les tests d’activité, la cristallographie, les interactions protéine-protéine, les interactions protéine-ADN.
Des protéines garanties, abordables et prêtes à l’emploi en quelques semaines.
Pureté >80% ou Pureté >90%.
Des données de l'ADN à la protéine purifiée
Déroulement d'un projet standard
1- Conception de la séquence
Un certain nombre d’études ont révélé que le biais d’utilisation des codons peut entraîner de graves problèmes d’expression. La présence de codons rarement utilisés par la machinerie de traduction de l’hôte conduit souvent à :
• Une réduction du taux de traduction de l’ARNm cible.
• Une mauvaise incorporation des acides aminés.
• Des polypeptides ou des protéines tronqués ou supprimés par des acides aminés.
• Protéines à cadre décalé.
Le résultat global est une production de protéines faible ou indétectable.
Pour résoudre les problèmes liés au biais d’utilisation des codons, la séquence d’ADN cible peut être redéfinie par des changements de codons en utilisant la table de fréquence d’utilisation appropriée pour l’organisme hôte : c’est l’optimisation des codons. Cette approche générale a permis d’améliorer considérablement l’expression des protéines hétérologues dans de nombreux cas.
Le processus de conception du projet comprend l’ajout de TAGS N-/C- terminus à des fins de purification et de détection.
2- Synthèse et caractérisation des gènes
• L’ADN est synthétisé à partir d’oligonucléotides.
• L’ORF synthétique est construit et cloné dans notre plasmide standard pUC à nombre de copies élevé.
• Les colonies transformées sont criblées, une première série de cinq clones positifs est sélectionnée, amplifiée et purifiée.
• La séquence d’ADN est confirmée.
3- Sous-clonage dans un vecteur d'expression
• Préparation du plasmide, digestion de restriction et purification sur gel du fragment cible, ligature du fragment dans le(s) vecteur(s) le(s) mieux adapté(s) à votre hôte.
• Transformation des cellules, croissance des cultures sous pression sélective, mini préparation de l’ADN.
• Confirmation de la séquence d’ADN.
• Préparation des plasmides Midi/Maxi pour le vecteur cloné confirmée.
4- Essai d'expression des protéines et optimisation
• Transfection à petite échelle et flacons réacteurs pour déterminer le niveau d’expression du gène.
• Analyse SDS-PAGE des produits d’expression dans différentes conditions testées.
• Expression à grande échelle.
5- Purification et caractérisation des protéines à grande échelle
• Colonne de chromatographie d’affinité standard à base de TAG, suivie d’une chromatographie d’échange d’ions et/ou de filtration sur gel.
• Expérience de repliement si nécessaire.
• Détermination de la concentration.
• Expériences de SDS-PAGE et de WESTERN BLOT.
Services optionnels disponibles
• Élimination des TAG
• Élimination des endotoxines
• Augmentation de la fermentation et de la purification
Par où commencer ?
Vous pouvez nous contacter par courrier électronique à l’adresse suivante : protein@genosphere-biotech.com .
Veuillez inclure les informations suivantes :
• La séquence de votre gène ou de votre protéine ou le numéro d’accès UniProt
• Le(s) système(s) d’expression que vous préférez
• La quantité en mg de protéine recombinante nécessaire
• Le niveau de purification requis : >80% ou >90%
• Cinq systèmes d'expression
• Expression dans la bactérie Escherichia coli
• Expression dans la levure Pichia pastoris
• Expression dans des cellules d’insectes infectées par des baculovirus
• Expression dans des cellules HEK ou CHO
• Expression in vitro (machinerie enzymatique de transcription et de traduction d’E. coli)
• Niveaux standard de pureté des protéines
Choix des niveaux de purification requis :
• Pureté > 80 %
ou
• Pureté > 90 %.
• Pureté > 80 %
ou
• Pureté > 90 %.
• Étiquettes de purification par affinité
• N- ou C-terminal
• Fusion de la glutathion S-transférase (étiquette GST)
• 6x ou 10x résidus histidine ((His)6 ou (His10)tag)
etc…