Spectrométrie de masse des peptides

La spectrométrie de masse est définie par l’IUPAC comme l’étude de la matière par formation d’ions en phase gazeuse, détectés et caractérisés selon leur masse et leur charge.

Autrement dit, il s’agit d’une technique analytique qui consiste à peser des ions en phase gazeuse afin d’établir avec une grande précision la masse de molécules individuelles.

Selon la thermostabilité de l’échantillon, différentes techniques d’ionisation peuvent être utilisées :
Impact électronique (EI)
Ionisation chimique (CI)
Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)
Ionisation par électrospray (ESI)
Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI)

Les peptides sont des molécules thermolabiles et nécessitent des techniques d’ionisation douce. Les approches les plus courantes utilisent l’électrospray (ESI) et la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI). En MALDI, l’espèce MH+ est généralement l’ion dominant observé dans le spectre de masse, tandis que l’ESI-MS produit des ions multichargés, [M+nH]n+.

Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)

Certains phénomènes doivent être pris en compte lors de l’utilisation et de l’interprétation de la MS MALDI-TOF. Le degré d’ionisation et d’éjection en phase gazeuse d’un peptide donné détermine l’intensité du pic. Cette intensité dépend de la séquence, de la masse et de l’échantillon. Certains peptides de masse moléculaire élevée peuvent donner un pic d’ion moléculaire de faible intensité avec cette approche. Une autre possibilité consiste à utiliser une technique d’ionisation de plus haute énergie, comme l’électrospray. Un autre phénomène inhérent est le léger élargissement des pics MH+, dû à de très faibles différences locales d’énergie absorbée pendant les impulsions laser UV initiales entre des ions peptidiques similaires ; cela entraîne de légères différences de temps de vol et donc un spectre plus large. Les procédures d’étalonnage de routine permettent une erreur moyenne de masse de 0,1 %.

MS MALDI-TOF et ES d’un peptide de 42 aa (masse molaire théorique 4497).

Deux analyses indépendantes en MS MALDI-TOF. (a) Peptide de 21 aa (masse molaire théorique 2404).

Peptide de 8 aa (masse molaire théorique 854).

Ionisation par électrospray (ESI)

En ESI-MS, les analytes sont introduits en solution dans le spectromètre de masse. La production d’ions en phase gazeuse se fait à pression atmosphérique par formation de gouttelettes chargées à l’extrémité d’un capillaire ES chargé. La réduction de taille des gouttelettes par évaporation du solvant et fissions répétées produit des ions en phase gazeuse fortement chargés (protonation des acides aminés basiques Lys, Arg, His et de l’extrémité N-terminale), séparés selon leur rapport masse/charge (m/z). Pour obtenir la protonation, les analytes doivent être basiques à la fois en solution (pH faible) et en phase gazeuse. La séquence primaire et le pKb des groupes amino ionisables du peptide sont souvent des facteurs importants pour déterminer le nombre de protonations lors de l’analyse ESI-MS positive.

Même si les mécanismes de l’ESI restent discutés, il est établi que la réponse ESI observée (sélectivité, distribution des états de charge et intensité des ions dans le spectre de masse) est influencée par les paramètres instrumentaux, la concentration de l’analyte, le solvant, la basicité de l’analyte, la tension superficielle du solvant, la basicité en phase gazeuse et le pH. Des propriétés comme le nombre et le type d’acides aminés et la conformation jouent aussi un rôle dans l’état de charge maximal et la distribution des états de charge. Pour les peptides qui présentent peu de structure secondaire et tertiaire, cette distribution est indépendante de la structure secondaire.

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