Notes techniques - anticorps personnalisés

Identification de peptides antigéniques

Les protéines sont généralement de bons antigènes lorsqu’elles sont utilisées avec un hôte approprié, mais elles ne sont souvent pas disponibles en quantité ou en pureté suffisante pour générer des anticorps.
Une autre approche consiste à utiliser une portion (poly)peptidique dérivée de la séquence de la protéine cible.
Les polypeptides (>100-150 aa) peuvent être produits par synthèse chimique de l’ADN codant correspondant puis expression hétérologue. Le coût de production des ORF synthétiques diminuant, la voie de synthèse de gènes devient plus attractive.
Une approche plus courante, et généralement plus économique, consiste à concevoir une séquence peptidique plus courte (10 à 30 aa) pour une synthèse chimique totale, suivie d’une conjugaison à une protéine porteuse afin d’obtenir un excellent immunogène pour la production d’anticorps anti-peptides. Cette méthode permet notamment de générer des anticorps capables de discriminer des protéines homologues et de purifier les anticorps obtenus par chromatographie d’affinité sur colonnes peptidiques.

Déterminants antigéniques

Des anticorps anti-peptides réussis reconnaissent avec une forte spécificité des épitopes peptidiques sur les protéines dans leur environnement natif. Les épitopes doivent donc être accessibles à ces macromolécules volumineuses que sont les anticorps.
Le peptide doit être choisi dans une région de la protéine naturellement exposée au milieu de solvatation, d’autant plus si l’anticorps doit être utilisé en immunohistochimie, microscopie confocale ou cytométrie en flux, où la détection vise les structures 3D natives. Les zones les plus susceptibles d’être accessibles sont hydrophiles, car elles sont le plus souvent en contact avec le milieu aqueux.
La séquence peptidique doit être unique et non conservée dans une protéine connue susceptible d’interférer avec le système expérimental. Enfin, le peptide doit être immunogène pour l’animal hôte.
À l’aide de logiciels d’analyse de séquence, il est possible d’identifier plusieurs séquences présentant des caractéristiques optimales d’hydrophilie, d’accessibilité et de flexibilité.

Sélection de séquence

La faisabilité de la synthèse chimique, de la purification et de la conjugaison des séquences sélectionnées doit aussi être prise en compte lors de la conception des peptides cibles. De manière générale, essayez de maintenir un rapport résidus hydrophiles/résidus hydrophobes proche de 1:1. Évitez autant que possible les acides aminés réactifs (C, M, W). Contactez-nous avec votre séquence : nous l’évaluerons pour vous.

Longueur de séquence

Les données expérimentales indiquent que le plus petit antigène peptidique mesure environ 5 à 10 aa. Même si nous avons obtenu des résultats avec des peptides de seulement 4 aa, il est recommandé d’utiliser au minimum 10 aa comme épitope peptidique. Un bon compromis entre spécificité, difficulté de synthèse chimique et coût se situe autour de peptides de 15 aa. Des peptides plus longs (par exemple 18-25 aa) sont possibles et peuvent dans de nombreux cas améliorer la spécificité.

Extrémités de séquence

Pour une séquence située à l’intérieur de la protéine cible, on peut envisager de neutraliser les charges terminales (NH3+ ou COO-) au moyen d’extrémités C-amide ou N-acétyle/formyle, afin de mieux mimer l’environnement électronique de l’épitope.
Pour les séquences issues de la partie C-terminale de la protéine, la conjugaison doit être réalisée sur l’extrémité N du peptide, et inversement pour les épitopes N-terminaux.

Approche de co-immunisation multi-peptides

Dans certains cas, afin d’augmenter les chances de produire un pool d’anticorps détectant la protéine native, plusieurs épitopes peptidiques d’une même séquence protéique peuvent être choisis et utilisés comme antigènes dans un protocole de co-immunisation. Une augmentation du bruit de fond peut être observée.

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