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Proteinexpression in E. coli
Die Expression von Proteinen in E. coli ist die kostengünstigste und am häufigsten verwendete Methode. Es eignet sich besonders für die Herstellung von Antigenen, Liganden, Zytokinen oder bakteriellen Proteinen. Die relative Einfachheit des Systems und die Kenntnis der Wirtsgenetik haben es zu einem System der Wahl gemacht. Darüber hinaus hat E. coli eine kurze Kulturdauer und bietet die Möglichkeit, hohe Erträge zu erzielen.
In den letzten Jahrzehnten wurde das E. coli-Expressionssystem weiterentwickelt und durch seinen intensiven Einsatz in der Forschung und bei industriellen Anwendern für eine Vielzahl von rekombinanten Proteinexpressionen dokumentiert.
Beschreibung der Dienstleistung
Die Herstellung von rekombinantem Protein umfasst mehrere Schritte vom Gen bis zum gereinigten Protein, wie in der nachstehenden Tabelle beschrieben.
Die Produktionszeit beträgt etwa 8 bis 10 Wochen.
| Arbeitsschritte (1-6) | Zwischenprodukte | Durchschnittliche Bearbeitungszeit (*) |
| 1. Gensynthese | ||
| -Codon Optimierung
-Gensynthese -Klonierung in Standard pUC Plasmid -Vollständige Sequenzierung |
verifiziertes Gen in pUC Plasmid |
1-2 Wochen |
| 2. Subklonierung in Baculovirus-Transfervektor | ||
| -Plasmidpräparation
-Subklonierung “Bac-Donor” -Vektor -Klonauswahl -Vollständige Sequenzierung |
verifiziertes Gen in „Bac-Donor“-Vektor |
2 Wochen |
| 3. Bacmid Herstellung | ||
| -Plasmidpräparation
-Rekombinante Bacmid Selektion -Rekombinante Bacmid DNA Isolation -Vollständige Sequenzierung |
verifiziertes Gen in Bacmid DNA |
2 Wochen |
| 4. Insektenzelltransfektion | ||
| -Mehrere Sf9 Transfektionen
-Virustiterbestimmung -SDS-PAGE / Western Blot Analyse |
hochtitriger rekombinanter Baculovirus |
3 Wochen |
| 5. Expression im Pilotmaßstab | ||
| -Expression im Pilotmaßstab und Optimierung der Kultivierungsbedingungen -Bestimmung der Ausbeute und Proteineigenschaften |
10-50 µg teilgereinigtes Protein |
1-2 weeks |
| 6. Expression und Proteinreinigung | ||
| -Expression
-Proteinextraktion -ProteinReinigung -SDS-PAGE, WESTERN Blot |
0.1 bis 3 mg gereinigtes Protein Reinheit >95% |
2-3 Wochen |
(*) Durchschnittliche Bearbeitungszeit und Herstellungsdauer. Die tatsächliche Lieferzeit kann in Abhängigkeit von z.B. DNA-Sequenz, Reinigungsschritten usw. davon abweichen. Wir informieren Sie per E-Mail zeitnah über den aktuellen Stand Ihres Projektes.