Hefeexpressionssysteme wie Pichia pastoris sind bevorzugte Werkzeuge für die hohe Expression von richtig gefalteten sekretorischen Proteinen und die begrenzte Produktion von endogenen sekretorischen Proteinen.
Es ist ein kostengünstiges eukaryotisches Expressionssystem, das sowohl die Sekretion als auch die intrazelluläre Expression ermöglicht. Posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung, Phosphorylierung und Acylierung, die für die biologischen Aktivitäten entscheidend sind, wurden dokumentiert. Es eignet sich besonders für die Expression und Herstellung eukaryotischer Funktionsproteine wie Defensin, Interleukin und Zytokine. Die häufig beobachtete effiziente Sekretion korrekt gefalteter Proteine in das extrazelluläre Medium ermöglicht die Herstellung hochreiner funktioneller Proteine.
Alle Dienstleistungen umfassen mehrere Schritte vom Gen bis zum gereinigten Protein, wie in der nachstehenden Tabelle beschrieben.
Die Vorlaufzeit beträgt etwa 9-12 Wochen.
Arbeitsschritte (1-6) | Zwischenprodukte | Durchschnittliche Bearbeitungszeit (*) |
1. Gensynthese | ||
- Codon Optimierung
- Gensynthese - Klonierung in Standard pUC Plasmid - Vollständige Sequenzierung |
verifiziertes Gen in pUC Plasmid | 1-2 Wochen |
2. Subklonierung in Baculovirus-Transfervektor | ||
- Plasmidpräparation
- Subklonierung "Bac-Donor” - Vektor - Klonauswahl - Vollständige Sequenzierung |
verifiziertes Gen in "Bac-Donor“-Vektor | 2 Wochen |
3. Bacmid Herstellung | ||
- Plasmidpräparation
- Rekombinante Bacmid Selektion - Rekombinante Bacmid DNA Isolation - Vollständige Sequenzierung |
verifiziertes Gen in Bacmid DNA | 2 Wochen |
4. Insektenzelltransfektion | ||
- Mehrere Sf9 Transfektionen
- Virustiterbestimmung - SDS-PAGE / Western Blot Analyse |
hochtitriger rekombinanter Baculovirus | 3 Wochen |
5. Expression im Pilotmaßstab | ||
- Expression im Pilotmaßstab und Optimierung der Kultivierungsbedingungen
- Bestimmung der Ausbeute und Proteineigenschaften |
10-50 µg teilgereinigtes Protein | 1-2 weeks |
6. Expression und Proteinreinigung | ||
- Expression
- Proteinextraktion - ProteinReinigung - SDS-PAGE, WESTERN Blot |
0.1 bis 3 mg gereinigtes Protein
Reinheit >95% |
2-3 Wochen |
(*) Durchschnittliche Bearbeitungszeit und Herstellungsdauer. Die tatsächliche Lieferzeit kann in Abhängigkeit von z.B. DNA-Sequenz, Reinigungsschritten usw. davon abweichen. Wir informieren Sie per E-Mail zeitnah über den aktuellen Stand Ihres Projektes.