Technische Hinweise - kundenspezifische Peptide

Massenspektrometrie von Peptiden

Massenspektrometrie wird von der IUPAC als Untersuchung von Materie durch Bildung gasförmiger Ionen definiert, die anhand ihrer Masse und Ladung nachgewiesen und charakterisiert werden.

Anders gesagt ist sie eine analytische Technik, bei der Ionen in der Gasphase gewogen werden, um die Massen einzelner Moleküle mit hoher Präzision zu bestimmen.

Je nach Thermostabilität der Probe stehen verschiedene Ionisationstechniken zur Verfügung:
Elektronenstoßionisation (EI)
Chemische Ionisation (CI)
Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI)
Elektrospray-Ionisation (ESI)
Atmosphärendruck-chemische Ionisation (APCI)

Peptide sind thermolabile Moleküle und benötigen weiche Ionisationstechniken. Die gängigsten Ansätze sind Elektrospray (ESI) und MALDI. Bei MALDI ist die Spezies MH+ meist das dominierende Ion im Massenspektrum, während ESI-MS mehrfach geladene Ionen [M+nH]n+ erzeugt.

Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI)

Bei Einsatz und Interpretation der MALDI-TOF-MS sollten einige Phänomene berücksichtigt werden. Das Ausmaß von Ionisation und Ausstoß in die Gasphase bestimmt die Peakintensität eines Peptids; sie hängt von Sequenz, Masse und Probe ab. Peptide mit höherer Molekülmasse können bei dieser Methode nur schwache Molekülionenpeaks liefern. Alternativ kann eine Ionisationstechnik mit höherer Energie wie die Elektrospray-Ionisation eingesetzt werden. Ein weiteres inhärentes Phänomen ist die leichte Verbreiterung von MH+-Peaks durch sehr kleine lokale Unterschiede der absorbierten Energie während der ersten UV-Laserpulse, was zu minimal unterschiedlichen Flugzeiten und damit zu breiteren Spektren führt. Routinemäßige Kalibrierung ermöglicht einen durchschnittlichen Massenfehler von 0,1 %.

MALDI-TOF- und ES-MS eines 42-aa-Peptids (theoretische molare Masse 4497).

Zwei unabhängige MALDI-TOF-MS-Analysen. (a) 21-aa-Peptid (theoretische molare Masse 2404).

8-aa-Peptid (theoretische molare Masse 854).

Elektrospray-Ionisation (ESI)

In der ESI-MS werden Analyten in Lösung in das Massenspektrometer eingebracht. Gasphasenionen entstehen bei Atmosphärendruck durch geladene Tröpfchen an der Spitze einer geladenen ES-Kapillare. Durch Verdampfung des Lösungsmittels und wiederholte Spaltung der Tröpfchen entstehen hochgeladene Gasphasenionen (Protonierung basischer Aminosäuren Lys, Arg, His sowie des N-Terminus), die nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) getrennt werden. Für die Protonierung müssen die Analyten sowohl in Lösung (niedriger pH) als auch in der Gasphase basisch sein. Die Primärsequenz und der pKb der ionisierbaren Aminogruppen des Peptids beeinflussen häufig die Zahl der Protonierungen in der positiven ESI-MS.

Obwohl die ESI-Mechanismen weiter diskutiert werden, ist gut belegt, dass die beobachtete ESI-Antwort durch instrumentelle Parameter, Analytenkonzentration, Lösungsmittel, Analytenbasicität, Oberflächenspannung, Gasphasenbasicität und pH beeinflusst wird. Auch Anzahl und Art der Aminosäuren sowie die Konformation spielen eine Rolle für den maximalen Ladezustand und die Verteilung der Ladezustände. Bei Peptiden mit geringer Sekundär- und Tertiärstruktur ist diese Verteilung unabhängig von der Sekundärstruktur.

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