Technische Hinweise - kundenspezifische Gene

Sequenzoptimierung für die Proteinexpression

Heterologe Proteinexpression

Ein Projekt zur heterologen Proteinexpression kann anspruchsvoll sein. Unter den vielen Faktoren, die den Expressionserfolg beeinflussen, ist die tatsächlich verwendete codierende Sequenz häufig entscheidend. Es kann vorteilhaft sein, ausgehend von der Proteinsequenz eine expressionsfreundliche DNA-Sequenz neu zu entwerfen oder de novo zu erstellen.

Schwache oder fehlende Expression, trunkierte Proteine und Fehlinkorporationen von Aminosäuren sind die häufigsten Folgen von Codon-Bias und einem unausgeglichenen tRNA-Pool.

Dieses Problem wurde für die E. coli-Expression umfassend untersucht. Besonders anschaulich sind die Arginin-Codons AGG und AGA, die dieselbe tRNA nutzen: Sie kommen in stark exprimierten ORFs von E. coli kaum vor, sind aber in vielen anderen Organismen deutlich häufiger. Daher ist es oft sinnvoll, sie durch Codons zu ersetzen, die im Zielorganismus häufiger verwendet werden, z. B. CGT oder CGC.

	Codonfrequenz (AGG + AGA) (% aller Arg-Codons)
Expressionswirt (stark exprimierte Gene, Henaut und Danchin, Escherichia coli and Salmonella, Vol. 2, Ch. 114:2047-2066, 1996)
E. coli	0,9
Quelle des rekombinanten Gens (Frequenzen aller Gene, www.kazusa.or.jp/codon/)
A. thaliana	55
C. elegans	37
D. melanogaster	12
H. sapiens	42
S. cerevisae	69

Gendesign

Ein Gen so zu entwerfen, dass es in einem bestimmten Organismus ein rekombinantes Protein exprimiert, bedeutet im Kern, für jede Aminosäure das am besten geeignete Triplett auszuwählen. Bei 64 Codons für 20 aa plus Termination besteht genügend Flexibilität, um neben der Anpassung des Codon-Bias weitere Anforderungen einzubeziehen, etwa:

Gen- und Proteinengineering: Hinzufügen oder Entfernen bestimmter Motive (z. B. Restriktionsschnittstellen), Tags zur Reinigung, mehrere Stoppsignale usw.
Genherstellung: durchschnittlichen GC-Gehalt beibehalten, lange Wiederholungen, Palindrome usw. vermeiden.