Technische Hinweise - kundenspezifische Antikörper

Identifizierung antigener Peptide

Proteine sind bei geeignetem Wirt meist gute Antigene, stehen aber oft nicht in ausreichender Menge oder Reinheit zur Antikörpererzeugung zur Verfügung.
Eine Alternative besteht darin, einen (Poly-)Peptidabschnitt aus der Zielproteinsequenz zu verwenden.
Polypeptide (>100-150 aa) können über die chemische Synthese der entsprechenden codierenden DNA und anschließende heterologe Expression hergestellt werden. Da die Kosten für synthetische ORFs sinken, wird die Gensynthese zunehmend attraktiv.
Eine häufiger genutzte und weiterhin wirtschaftlichere Methode ist das Design einer kürzeren Peptidsequenz (10 bis 30 aa) für die vollständige chemische Synthese, gefolgt von der Konjugation an ein Trägerprotein. So entsteht ein sehr gutes Immunogen für die Produktion von Anti-Peptid-Antikörpern. Diese Methode bietet Vorteile wie die Erzeugung von Antikörpern, die zwischen homologen Proteinen unterscheiden können, sowie die Möglichkeit, die erhaltenen Antikörper über Peptid-Säulen affinitätschromatographisch zu reinigen.

Antigene Determinanten

Erfolgreiche Anti-Peptid-Antikörper erkennen Peptidepitope mit hoher Spezifität auf Proteinen in ihrer nativen Umgebung. Daher müssen die Epitope für die großen Antikörpermoleküle zugänglich sein.
Das Peptid sollte aus einer Proteinregion gewählt werden, die natürlicherweise dem Lösungsmittel ausgesetzt ist, insbesondere wenn der Antikörper in Immunhistochemie, konfokaler Mikroskopie oder Durchflusszytometrie eingesetzt werden soll, wo native 3D-Strukturen nachgewiesen werden. Am wahrscheinlichsten zugänglich sind hydrophile Bereiche, da sie Kontakt mit dem wässrigen Umfeld haben.
Die Peptidsequenz sollte einzigartig sein und nicht in bekannten Proteinen konserviert sein, die das spezifische experimentelle System stören könnten. Schließlich muss das Peptid für das Wirtstier immunogen sein.
Mit Hilfe von Sequenzanalyse-Software lassen sich mehrere Sequenzen identifizieren, die hinsichtlich Hydrophilie, Zugänglichkeit und Flexibilität optimale Eigenschaften aufweisen.

Sequenzauswahl

Die Machbarkeit von chemischer Synthese, Reinigung und Konjugation der ausgewählten Sequenz(en) sollte beim Design der Zielpeptide ebenfalls berücksichtigt werden. Im Allgemeinen sollte das Verhältnis hydrophiler zu hydrophoben Resten etwa 1:1 betragen. Reaktive Aminosäuren (C, M, W) sollten möglichst vermieden werden. Kontaktieren Sie uns mit Ihrer Sequenz; wir prüfen sie für Sie.

Sequenzlänge

Experimentelle Daten deuten darauf hin, dass die kleinsten Peptidantigene 5-10 aa lang sind. Obwohl wir auch mit 4-aa-Peptiden erfolgreich waren, wird ein Minimum von 10 aa als Peptidepitop empfohlen. Ein guter Kompromiss zwischen Spezifität, Schwierigkeit der chemischen Synthese und Kosten liegt bei etwa 15-aa-Peptiden. Längere Peptide (z. B. 18-25 aa) sind möglich und können in vielen Fällen die Spezifität verbessern.

Sequenzenden

Bei einer Sequenz innerhalb des Zielproteins kann erwogen werden, die terminalen Ladungen (NH3+ oder COO-) durch C-Amid- oder N-Acetyl/Formyl-Enden zu neutralisieren, um die elektronische Umgebung des Epitops besser nachzubilden.
Bei Sequenzen aus dem C-terminalen Teil des Proteins sollte die Konjugation am N-Ende des Peptids erfolgen, bei N-terminalen Epitopen entsprechend umgekehrt.

Multi-Peptid-Co-Immunisierung

In manchen Fällen kann es sinnvoll sein, mehrere Peptidepitope innerhalb derselben Proteinsequenz auszuwählen und als Antigene in einem Co-Immunisierungsprotokoll einzusetzen, um die Wahrscheinlichkeit eines Antikörperpools zu erhöhen, der das native Protein erkennt. Ein erhöhter Hintergrund kann dabei auftreten.

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