Anti-Peptid Antikörper

<strong>Abb 1.</strong> Drei 15 AS Peptide wurden synthetisiert, gereinigt und an KLH konjugiert, die 3 erhaltenen Immunogene wurden dann unabhängig voneinander genutzt, um polyklonale Antikörper in Kaninchen zu bilden. Die Sequenzen der Peptide unterschieden sich wechselseitig durch jeweils 8 AS. Eine „ELISA Kreuzreaktivitätsanalyse”, bei der die Antikörper in 1:10.000 Verdünnungen eingesetzt wurden, wurde durchgeführt. Die Resultate zeigen deutlich, dass bei den 3 produzierten Antiseren jeweils eine vollständige (negative) Diskriminierung gegenüber den 2 anderen Antigenen stattfindet und diese im ELISA in einem „UV-Absorptions“-Bereich liegt, der den Kontrollgruppen (Prä-Immunseren) entspricht.<br/>
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Wenn Ihnen ein Protein nicht als Antigen zur Verfügung steht, so besteht die Möglichkeit aus der publizierten AS-Sequenz des Proteins kürzere Abschnitte von 10 bis 25 AS Länge auszuwählen und diese Peptide dann synthetisieren zu lassen. Die so hergestellten Peptide können Sie dann als Antigene zur Produktion von anti-Peptid Antikörpern verwenden. 

Genosphere Biotechnologies bietet Ihnen einen vollständigen und umfassenden anti-Peptid Antikörper Service an.Teilen Sie uns ihre Peptidsequenzen mit, wählen Sie die Tierspezies aus und wir produzieren für Sie innerhalb von 14 Wochen ein hochtitriges Antiserum. Gerne unterstützen wir Sie beim Design ihres Projektes und bei der Auswahl der Peptid¬sequenzen.  Viele Faktoren beeinflussen die Qualität eines anti-Peptid Antikörpers, deshalb ist eine sorgfältige Planung und Durchführung der Peptidsynthese für das Erreichen einer guten Spezifität und ausgereiften Sequenzdiskriminierung wichtig (Abb. 1).

Standard „anti-Peptid Service Paket“ : Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten und Mäuse.

Das Standard “anti-Peptid Service Paket” beinhaltet

  • Synthese, Reinigung & KLH Konjugation ihres Peptides
  • Immunisierung ihrer Tiere:

    • Kaninchen: 60-100 ml ELISA getestetes Antiserum
    • Meerschweinchen: 5-15 ml dto
    • Ratten: 3-5 ml dto
    • Mäuse: 2-3 ml dto

  • Prä-Immunserum zu Kontrollzwecken
  • Qualitäts-Report mit den ELISA Analysedaten.
  • 5 mg des unkonjugierten Peptids (mit HPLC & MS Daten, Reinheit >90%)

Alternativ können wir ein spezielles von Ihnen vorgeschlagenes Protokoll oder ein auf ihre spezifischen Bedürfnisse zugeschnittenes Programm durchführen. Hierbei können z.B. die Zeitabstände zwischen den Immunisierungsschritten, die Anzahl der Tiere oder die Auswahl der Tierspezies variiert werden. Bei allen Projekten besteht immer auch die Möglichkeit einer zeitlichen Verlängerung (kostenpflichtig), wodurch weitere Antiserumabnahmen möglich werden.

<strong>Abb 2.</strong> Jedes Antikörper-Projekt durchläuft einen stringenten Qualitätskontrollprozess, der die ELISA Titration des Antiserums gegen das Prä-Immunserum als Negativkontrolle ebenso beinhaltet, wie die Analyse der Peptidqualität durch RP-HPLC und Massenspektrometrie (MS, MALDI-TOF).<br/>
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Peptid-Carrierprotein Konjugation

Synthetische Peptide sind zu klein, um eine für die Antikörperproduktion in Tieren ausreichende Immunantwort hervorzurufen. Aus diesem Grund werden sie selten in reiner Form als Antigene eingesetzt. Stattdessen werden Peptide kovalent an ein größeres Protein gekoppelt. Das daraus resultierende Konjugat wird dann als Immunogen verwendet. Es ist für eine erfolgreiche Immunisierung entscheidend wichtig, dass das molare Verhältnis von “Peptid” und “Carrierprotein” sehr hoch ist. Als zweites müssen alle Epitope auf den Peptiden für die Immunzellen frei zugänglich angeordnet sein, damit sie eine hohe und spezifische Immunantwort hervorrufen können. Aus diesen beiden genannten Punkten wird ersichtlich, dass in der Qualität der Peptidsynthese und der sorgfältigen Durchführung der Konjugation des Peptides an das Carrierprotein, der Schlüssel zur Durchführung eines erfolgreichen Immunisierungsprojektes liegt.

Peptid-KLH-Carrier Konjugationen und MAPs

  • Carrierprotein: KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin). KLH ist ein Protein mit einem sehr hohen Molekulargewicht, das aus einer Meeresschneckenart isoliert wird. KLH besitzt eine sehr potente Antigenizität in Säugetieren und Vögeln. Außerdem weist es eine größere Anzahl freier Aminogruppen auf, die für die Kopplung von Haptenen (Peptiden) zur Verfügung stehen.
  • Kopplung von KLH an Peptide via einem terminalen Cystein (N- oder C-terminal): Die Peptide sollten mindestens 10 AS lang sein und N- oder C-terminal ein Cystein aufweisen, um so das Carrierprotein effektiv koppeln zu können. In manchen Fällen jedoch werden Antikörper auch gegen kürzere Peptidsequenzen benötigt.

Hierzu haben wir ein spezielles Protokoll entwickelt, das auch bei vorliegen von kurzkettigen Peptiden (5-10 AS) zu sehr guten Ergebnissen führt. Wieder andere Immunisierungsprojekte erfordern es z.B., dass das Carrierprotein direkt an die N-terminale Aminogruppe des Peptids gekoppelt werden muß. Sollten Sie Fragen zu Ihrem Projekt haben, dann nehmen Sie bitte Kontakt mit uns auf. Wir beraten Sie gerne.

<strong>Abb 3.</strong> Graphische Darstellung der Computerberechnung (Algorithmus) über die wahrscheinliche Antigenizität unterschiedlicher Abschnitte auf einem Protein. Die dunkelgrünunterlegten Felder repräsentieren Peptidsequenzen, innerhalb des Proteins, die den gewählten Parametern zur Auswahl antigener Determinanten am besten entprechen (Score).<br/>
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Multiple Antigen Peptides (MAP) 

Die Verwendung von „multiple antigen peptides“ (MAP) stellt in manchen Fällen eine gute Alternative zur Konjugation des Peptidhaptens an ein Carrierprotein dar. MAP besteht aus 8-16 Kopien des Peptidhaptens, die direkt an einem 8-16 fach verzweigten „Lysinkern“ an einem speziellen Harz synthetisiert werden. Das resultierende Peptid-Multimer ist ein großes Makromolekül (10-15 kDa), das keine weitere Kopplung an ein Carrier¬protein mehr benötigt.

Qualitätskontrolle

Die Qualität unserer synthetischen Peptide wird durch RP-HPLC und Massenspektro¬metrie geprüft. (Abb. 2). Die Immunantwort wird den gesamten Projektverlauf über kontrolliert und das Immunisierungsprogramm wird, wenn dies notwendig ist entsprechend angepasst. Der abschließende ELISA wird für jedes der immunisierten Tiere einzeln an den Antiseren und den prä-Immunseren durchgeführt, die Ihnen zugesandt werden. Wir garantieren mindestens einen „good titer” für alle ihre anti-Peptid Antiseren. (Abb. 2). Ein detailierter ELISA Report wird jedem ausgelieferten Projekt beigelegt.

Peptiddesign

Bei der Evaluation einer Proteinsequenz auf mögliche „antigene Determinanten“, ist es kritisch Regionen auszuwählen, die bekanntermaßen antigen und hydrophil sind, sowie auf sekundäre Strukturen zu achten, die einen guten Zutritt von Lösungsmitteln wie Wasser gewährleisten (Abb. 3). Die gute Synthetisierbarkeit der ausgewählten Peptide spielt außerdem eine Rolle bei der Planung eines Immunisierprojektes. Eines oder mehrere Peptide werden dann einzeln oder gemeinsam als Epitope für die Immunisation der Tiere eingesetzt. Die Antikörper, die so erzeugt werden, werden die ausgewählten Peptidsequenz(en) innerhalb des Zielproteins erkennen. Durch spezielle Softwareprogramme (Algorithmen) analysieren wir gerne auch Ihre Proteinsequenz und schlagen Ihnen dann mehrere „Peptidkandidaten“ vor, die für die Immunisierung in ihrem Projekt geeignet sind.

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