Anforderungen - Proteinproben

Anforderungen an die für den Edmann-Abbau geeigneten Proteinproben

Proteinmenge

Wir benötigen ein Minimum von 20 pmol des auf eine PVDF Membran geblotteten Proteins. Bitte stellen Sie uns, falls dies möglich ist, 50 pmol des Proteins zur Verfügung, so können wir sehr sicher sein, Ihnen die optimalen Sequenzdaten liefern zu können.

Proteingröße [kDa] 20 pmol Protein entsprechen: 50 pmol Protein entsprechen:
10 kDa 0,2 µg 0,5 µg
25 kDa 0,5 µg 1,25 µg
50 kDa 1,0 µg
2,5 µg
75 kDa 1,5 µg
3,75 µg
100 kDa 2,0 µg
5,0 µg
125 kDa 2,5 µg
6,25 µg

Probenart 

Wir nehmen Blots auf PVDF Membranen, lyophilisierte und gelöste Proteinproben entgegen.

Geblottete Proteine auf PVDF Membranen (bevorzugt) 

Das Protein sollte durch elektroblotten von 1 D oder 2 D Gelen auf eine PVDF Membran übertragen und mit Coomassie Blue (R250) gefärbt werden. Nach dem Färben / Entfärben , muss die geblottete PVDF Membran sorgfältig mit deionisierten Wasser gewaschen werden. Die Proteinprobe muß so konzentriert wie möglich vorliegen. Es können auch mehrere Bahnen (lanes) mit einem Protein beladen werden. Die ganze Membran kann an uns eingesandt werden oder aber nur die ausgeschnittenen Proteinbande(n). Machen Sie in jedem Fall eine Kopie der Membran auf der die Lage der Bahnen und die interessierenden Proteinbande(n) deutlich markiert sind. Geben Sie auch in jedem Fall das Molekulargewicht ihres Proteins an. Achten Sie darauf, dass die Molekulargewichts¬markerproteine nicht zu nah an der Bahn (lane) des interessierenden Proteins aufgetragen werden.

Proteine in Lösung oder als Lyophilisat 

Das Protein soll in 30 bis 150 µl Lösungsmittel vorliegen (Wasser, Acetonitril, Propanol). Das Protein muß immer frei von Detergenzien, Salzen und Puffern sein. Bitte beachten Sie, dass jedes Reagenz, das eine Amingruppe trägt (wie zum Beispiel auch Tris-Puffer) den Edman-Abbau negativ beeinträchtigt. Dies gilt auch für lyophilisierte Proteine.

Probenreinheit 

PVDF Blots: klar getrennte Banden sind gut. Mittels Immunopräzipitation und / oder Affinitätschromatographie gereinigte Proteine sind gute Proben. 
Lösung: Bei dieser Probenart (Lösung) führen wir immer einen zusätzlichen Reinigungsschritt durch, um sicherzustellen, dass die Probe keine Amingruppen tragenden Verunreinigungen mehr enthält. Diesen Reinigungsschritt stellen wir gesondert in Rechnung.

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